肿瘤微环境（TME）是一个独特的代谢生态位，它可以抑制T细胞代谢和细胞毒性。为了剖析肿瘤和T细胞之间的代谢作用，本研究建立了一个体外系统，该系统涵盖了TME的代谢生态位，并定义了细胞特异性代谢。本研究利用肿瘤来源的乳酸作为具有细胞毒性的CD8+ T细胞的抑制剂，来揭示三羧酸循环（TCA循环）中的代谢分流。细胞毒性T细胞将琥珀酸从TCA循环中分流出来，通过琥珀酸受体（SUCNR1）促进自分泌信号传导。细胞毒性T细胞依赖丙酮酸羧化酶（PC）来补充TCA循环中间体。相比之下，乳酸可减少PC介导的回补途径。抑制丙酮酸脱氢酶（PDH）可使PC活性恢复、琥珀酸分泌和SUCNR1的激活。以上研究确定了PDH为潜在的药物靶点，可使CD8+ T细胞保持细胞毒性并克服乳酸富集的TME。

亮点

1. 肿瘤来源的乳酸诱导了从PC向PDH的转换。

2. 抑制PDH增加PC活性和琥珀酸分泌。

3. 细胞外琥珀酸激活SUCNR1，促进T细胞的细胞毒性。

4. PDH的抑制与免疫治疗有协同作用。

论文ID

原名：Tumor cells dictate anti-tumor immune responses by altering pyruvate utilization and succinate signaling in CD8+ T cells

译名：肿瘤细胞通过调节CD8+ T细胞的丙酮酸和琥珀酸信号来介导抗肿瘤免疫反应

期刊：Cell Metabolism

IF：31.373

发表时间：2022.07

通讯作者：Marcia C. Haigis

通讯作者单位：马萨诸塞州波士顿哈佛医学院细胞生物学系

实验设计

实验结果

1. 模拟TME的营养条件会损害CD8+ T细胞的细胞毒性和PC活性

为了检测具有细胞毒性的CD8+ T细胞的代谢改变，我们用抗CD3/抗CD28、白介素-2（IL-2）和白介素-12（IL-12），作用72h，激活了识别鸡卵白蛋白（OVA）257-264肽的初始T细胞受体（TCR）转基因OT-1 CD8+ T细胞。这些活化的OT-1细胞中，部分包含了GFP+-B16黑色素瘤或GFP+-MC38结肠腺癌细胞（图1A）。当与表达OVA的肿瘤细胞一起培养时，这些活化的T细胞显示干扰素γ（IFNγ）、颗粒酶B（GzmB）和Ki67表达的抗原特异性增加。

由于TME反映了包括大量的肿瘤细胞在内的净代谢物消耗和分泌，我们比较了在新鲜RPMI培养基（洛斯维·帕克纪念研究所研发的一类培养基）或条件培养基（CM）中培养的T细胞的细胞毒性。在CM或RPMI中单独培养24h后，肿瘤细胞（图1B）和激活的CD8+ T细胞（图1C）的数量没有显著差异，说明CM不影响细胞活力。然而，当与肿瘤细胞共培养时，培养基组成显著影响CD8+ T细胞的活性。CM共培养显著降低了CD8+ T细胞的溶细胞活性以及IFNγ和GzmB的产生（图1D-1G）。当CD8+ T细胞与不表达OVA的B16细胞共培养时，CM对非特异性杀伤也有显著的抑制作用。这一结果表明，CM的抑制作用并不直接依赖于抗原信号传导。此外，对细胞数量进行检测，研究者发现在RPMI或CM培养基下，与肿瘤细胞一起培养的T细胞中，增殖标志物Ki67没有变化，这表明CM的影响使CD8+ T细胞效应功能（IFNγ、GzmB产生和细胞溶解）与细胞增殖的关系。

迄今为止，还没有一种方法能够从共培养中快速分离T细胞和肿瘤细胞进行进一步的代谢评估。我们开发了一种快速区分细胞大小的过滤方法，在几秒钟内将这些细胞群从共培养物中分离出来。流式细胞术分析证实肿瘤和T细胞群纯度为95%（图1I、1J）。

接下来，我们应用快速分离来评估共培养中与细胞溶解活性相对应的代谢变化，并检测在CM条件下T细胞代谢是否发生改变。为了绘制与细胞溶解活性相关的代谢谱，我们测量了在RPMI和CM条件下，在有无B16-OVA或MC38-OVA肿瘤细胞的情况下，活化CD8+ T细胞的13C6-葡萄糖利用情况。当比较单独生长或与肿瘤细胞共培养的CD8+ T细胞的代谢谱时，我们观察到共培养的CD8+ T细胞表现出中心碳代谢物中糖衍生碳增加，包括氨基酸和三糖循环中间体。虽然CM共培养的CD8+ T细胞在葡萄糖贡献方面表现出类似的诱导，但我们检测到这些碳进入三羧酸循环存在显著差异。葡萄糖衍生的丙酮酸可以通过PDH依赖的乙酰辅酶A的生成，而乙酰辅酶A与草酰乙酸结合形成柠檬酸。另外，丙酮酸也可以通过PC的活性生成草酰乙酸，为三羧酸循环贡献其完整的3个碳（图1K）。虽然在各种模型系统中，这两种酶都与促进线粒体代谢、细胞增殖和能量维持有关，但它们在CD8+ T细胞中的作用尚未确定。与CM中被抑制的T细胞共培养相比，在细胞溶解的T细胞共培养中，我们观察到两种丙酮酸转化酶（PC和PDH）具有不同活性。虽然在RPMI中共培养的CD8+ T细胞通过PC（M+3）和PDH（M+2）对TCA循环中间体苹果酸和富马酸的贡献增加，但在CM中共培养的CD8+ T细胞只显示出PDH衍生的碳的增加（图1L，1M）。为了评估PC活性的相对变化，我们直接比较了苹果酸M+3和琥珀酸M+3。虽然苹果酸M+3可以来自氧化TCA循环或PC活性，但由于反向琥珀酸脱氢酶（SDH）的通量很小或没有，琥珀酸M+3主要是由氧化TCA循环产生的。我们证实CM抑制了与肿瘤细胞共培养的CD8+ T细胞的PC活性。与CM对细胞毒性的影响一致，CM对PC活性的抑制作用是通过一种与抗原依赖性信号传导无关的机制驱动的，这是因为我们在与B16细胞共同培养的CD8+T细胞中也观察到相同的表型不表达OVA。

综上所述，这些结果表明，肿瘤细胞的存在可以刺激抗原特异性CD8+ T细胞IFNγ和GzmB的产生，改变CD8+ T细胞的代谢，但不能影响Ki67的表达。然而，CM以CD8+ T细胞独立的方式抑制CD8+ T细胞中IFNγ和GzmB的产生以及PC活性，表明肿瘤细胞形成的营养成分可以抑制CD8+ T细胞的效应功能，导致代谢重编程。

图1 TME模拟营养物质的利用率会损害CD8+T细胞的细胞毒性和PC活性。（A）在RPMI和CM中，CD8+T细胞活化，以及与肿瘤细胞共培养的示意图。T表示单独培养的T细胞，T co-c表示T细胞与肿瘤细胞共培养。（B）24h后检测RPMI和CM中B16-OVA肿瘤细胞的细胞数量。（C）24h后检测RPMI和CM单培养CD8+T细胞的细胞数量。（D-F）CD8+T细胞与B16-OVA肿瘤细胞共培养于RPMI或CM中，24h后检测死亡率以及GzmB和IFNγ的几何平均值。（G）24h后分析CD8+T细胞与B16-OVA肿瘤细胞共培养后分泌的IFNγ水平。（H）24h后分析CD8+T细胞与B16-OVA肿瘤细胞共培养中Ki67表达的几何平均值。（I）B16肿瘤细胞和CD8+T细胞的细胞大小的分离示意图。（J）流式细胞术测量过滤前后的T细胞群。（K）13C6-葡萄糖通过PDH或PC活性对TCA循环中间体的贡献示意图。灰色箭头表示低活动度。白色的圆圈表示碳12（12C），而黑色的圆圈表示葡萄糖的13C原子。（L和M）CD8+T细胞中13C6-葡萄糖对RPMI和CM中苹果酸和富马酸M+2（来自PDH活性）和M+3（来自PC活性）和与B16-OVA肿瘤细胞共培养的贡献。在共培养6h后进行分析。每个实验重复次数n=3。误差线表示SD。采用双尾非配对的学生t检验。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。

2. 肿瘤细胞分泌的乳酸可以重新介导CD8+ T细胞的代谢

为了确定CM中导致CD8+ T细胞活性抑制时的代谢物变化，我们直接比较了CM和RPMI的代谢物组成（图2A）。虽然在RPMI中检测到的大部分营养物质在CM中较低，但乳酸水平显著富集，达到10mM（图2A和图2B）。为了确定乳酸是否会在体内TME中积累到相同程度的水平，我们从植入B16-OVA肿瘤的小鼠中分离肿瘤间质液（TIF）和血浆（图2C）。乳酸水平在TIF中积累到11mM，而在血浆中为1mM。这些TIF乳酸水平与在CM中观察到的情况相似（图2D）。这些数据证实了乳酸积累是免疫抑制TME的一个特征，并提示肿瘤来源的乳酸可能是CD8+ T细胞代谢重组的驱动因素。

因此，我们用乳酸脱氢酶（LDH）抑制剂草氨酸钠处理肿瘤细胞，导致乳酸生成和分泌受阻。在CM培养中，经LDH抑制剂处理的细胞由于缺乏乳酸，在T细胞共培养物中对PC活性无抑制作用（图2E）。然而，在CD8+ T细胞共培养中，在CM或RPMI中添加乳酸足以损害PC的活性（图2E和图2F）。值得注意的是，在高乳酸培养基中，对CD8+ T细胞的杀伤作用以及GzmB和IFNγ的产量均减少（图2G-2J）。

综上所述，这些数据表明，肿瘤来源的乳酸导致CD8+ T细胞中PC活性降低和溶细胞活性降低。

图2 肿瘤细胞分泌的乳酸可以重新介导CD8+ T细胞的代谢。（A）表示肿瘤培养中CM与RPMI相比的代谢物变化的热图。肿瘤细胞培养24 h后获得CM。（B）在RPMI和CM中的细胞外的绝对乳酸水平。肿瘤细胞培养24 h后获得CM。（C）从B16-OVA肿瘤小鼠中血浆和TIF分离示意图。在肿瘤植入后第18天进行分析。（D）B16-OVA肿瘤小鼠TIF中的绝对乳酸水平。（E）CD8+T细胞与B16-OVA肿瘤细胞共培养的CM、LDH抑制剂培养的肿瘤细胞获得的CM、或LDH抑制剂+补充乳酸培养的肿瘤细胞获得的CM，来检测PC活性。培养6h后进行分析。（F）检测CD8+T细胞与B16-OVA肿瘤细胞在RPMI和RPMI+乳酸中共培养时的PC活性（10mM）。培养6h后进行分析。（G-I）CD8+T细胞与B16-OVA肿瘤细胞在RPMI或RPMI+乳酸（10mM）共培养中，24h后检测细胞死亡率、GzmB和IFNγ表达的几何平均值。（J）CD8+T细胞与B16-OVA肿瘤细胞在RPMI或RPMI+乳酸（10mM）共培养中分泌的IFNγ水平。培养24h后进行分析。每个实验重复次数n≥3。误差线表示SD。采用双尾非配对的学生t检验。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。

3. PDH抑制后可通过TCA循环失调来增加PC活性和CD8+ T细胞的细胞毒性

为了检测PC和PDH的活性和CD8+ T细胞效应功能之间可能的因果关系，我们接下来干预了丙酮酸氧化的两个分支（图3A）。首先，我们使用了靶向PC的shRNA，发现PC敲低（KD）的CD8+ T细胞，其细胞的杀伤作用、GzmB和IFNγ的产生均降低（图3B-3E），这表明PC活性是CD8+ T细胞发挥功能的必要条件。

由于PC和PDH的活性对丙酮酸进入线粒体至关重要，接下来我们检测了抑制PDH是否会导致丙酮酸促进PC活性的增加，从而证明即使在乳酸存在的情况下，抑制PDH也能导致CD8+ T细胞的细胞毒性。在存在或不存在CPI-613的情况下，我们进行了13C6-葡萄糖示踪，并检测了PC活性。在添加10mM乳酸的共培养物中，抑制PDH足以恢复PC活性和CD8+ T细胞的杀伤作用（图3F和3G）。此外，在RPMI共培养中，CPI-613处理进一步增加了PC活性、CD8+ T细胞杀伤和IFNγ，但没有增加GzmB（图3H-3K）。与我们之前的观察结果相似，通过Ki67的表达来测量，PDH的抑制并不影响增殖。PDH抑制对CD8+ T细胞杀伤和IFNγ产生的影响在MC38-OVA模型中得到了独立验证。此外，使用shRNA对PDH进行抑制也产生了类似的结果（图3L-3N）。

接下来，我们探究了由PDH抑制导致的高水平丙酮酸是否通过LDH增加了CD8+ T细胞中的乳酸产量。13C6-葡萄糖示踪表明，抑制PDH并不会增加葡萄糖衍生的丙酮酸对乳酸的通量，无论是否存在LDH抑制剂，LDH抑制剂草氨酸钠对CD8+T细胞的杀伤效率均无影响。

接下来，我们试图探究PC活性如何导致CD8+ T细胞的细胞毒性和IFNγ的产生。因为许多代谢物离开线粒体，作为生物合成或信号反应的前体，因此，一个有功能的TCA循环需要持续和平衡地补充其九个核心代谢物。由于草酰乙酸转化为柠檬酸这一步中，柠檬酸合成酶反应是不可逆的，而且琥珀酸脱氢酶A（SDHA）的通量很小或几乎没有，因此PC的活性主要与富马酸、苹果酸和草酰乙酸的补充有关。根据此，我们证明了在CD8+ T细胞中，PC衍生的碳标记了这些代谢物。补充草酰乙酸、苹果酸或富马酸培养基可完全逆转CD8+ T细胞抑制PC后的细胞毒性（图3O和3P）。最后，含有PC KD或在CM中培养的CD8+ T细胞不能通过补充α-酮戊二酸来挽救。综上，这些结果表明，PC活性需要补充TCA循环中间体来维持CD8+ T细胞的细胞毒性。

图3 抑制PDH通过TCA循环回补途径增加PC活性和CD8+ T细胞的细胞毒性。（A）PC和PDH活性的示意图。使用抑制剂CPI-613（100mM）抑制PDH。（B-D）用shRNA转导PC或CTRL并在RPMI中培养B16-OVA肿瘤细胞的CD8+T细胞，24h后统计死亡率、GzmB和IFNγ表达的几何平均值。（E）CD8+T细胞转导PC或CTRL，并与B16-OVA肿瘤细胞在RPMI中培养，24小时后检测分泌的IFNγ水平。（F）在RPMI+乳酸（10mM）培养基中，CD8+T细胞与B16-OVA肿瘤细胞在有无PDH抑制剂CPI-613下，6h后检测PC活性。CD8+T细胞用PDH抑制剂预处理24小时（先共培养）。（G）CD8+T细胞与B16-OVA肿瘤细胞共培养，PDH抑制剂CPI-613加入RPMI+乳酸（10mM）培养基中。CD8+T细胞用PDH抑制剂预处理24小时（先共培养），24h后进行检测。（h）CPI-613预处理后的B16-OVA肿瘤细胞与CD8+T细胞共培养，检测PC活性。CD8+T细胞用PDH抑制剂预处理24小时（先共培养），6h后进行检测。（I和J）CD8+T细胞与B16-OVA肿瘤细胞在RPMI中使用PDH抑制剂CPI-613共培养时，检测死亡率和IFNγ表达的几何平均值。CD8+T细胞用PDH抑制剂预处理24小时（先共培养），24小时后进行检测。（K）CD8+T细胞与RPMI中B16-OVA肿瘤细胞与PDH抑制剂CPI-613共培养后，检测分泌IFNγ的水平。CD8+T细胞用PDH抑制剂预处理24小时（先共培养），24h后进行检测。（L和M）用shRNA转导的CD8+T细胞与B16-OVA肿瘤细胞共培养后，24h后检测IFNγ的表达和几何平均值。（N）与RPMI中的B16-OVA肿瘤细胞共培养时，检测用shRNA转导PDH或CTRL的CD8+T细胞分泌的IFNγ水平。24小时后进行检测。（O）用shRNA转导PC的CD8+T细胞，与B16-OVA肿瘤细胞在分别加入OAA、苹果酸或富马酸中共培养。24小时后检测细胞的死亡率。（P）CD8+T细胞与B16-OVA肿瘤细胞共培养，分为RPMI+乳酸（10 mM）、RPMI+乳酸（10 mM）+OAA、RPMI+乳酸（10 mM）+苹果酸、RPMI+乳酸（10 mM）+富马酸组。24h后检测细胞的死亡率。每个实验重复次数n≥3。误差线表示SD。采用双尾非配对的学生t检验。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。

4. PC活性影响琥珀酸分泌和CD8+ T细胞发挥功能

由于CD8+ T细胞的溶细胞活性依赖于PC介导的TCA循环中间体的回补途径，我们接下来研究了这些代谢物是否可能主动排出具有溶细胞活性的CD8+ T细胞。当分析CD8+ T细胞单独培养或与肿瘤细胞共培养的培养基成分时，我们发现琥珀酸在肿瘤细胞存在下分泌增加，而这种作用在CM中被抑制（图4A）。由于PC可以生成所有由琥珀酸衍生的TCA循环中间体，我们接下来检测了CD8+ T细胞通过SDHA的活性将琥珀酸转化为富马酸、苹果酸和草酰乙酸的能力。跟预期的结果一致，肿瘤细胞共培养的T细胞与单独培养相比，其CD8+ T细胞的SDHA活性明显下降（图4B）。

SDHA活性的下调与我们的数据一致，表明PC在补充TCA循环的左侧通路部分发挥关键作用。因为我们没有观察到细胞内琥珀酸水平的显著差异，所以，我们通过在细胞外介质中补充这种代谢物来观察其发挥的作用。我们发现，在有或没有肿瘤源性乳酸或CM存在的情况下，外源性琥珀酸显著增加了CD8+ T细胞的杀伤作用和IFNγ的产生，但没有增加GzmB的产生（图4C，4D）。此外，我们发现PDH抑制可增加乳酸存在时的琥珀酸分泌率（图4E）。这些结果表明，细胞外琥珀酸是调节CD8+ T细胞活性的代谢物信号。

最后，我们用13C4-琥珀酸探究了琥珀酸在CD8+ T细胞中的作用（图4F）。在RPMI培养中的CD8+ T细胞中仅部分将13C4-琥珀酸运输到TCA循环中间体苹果酸中（图4G）。PC的KD显著增加了琥珀酸的掺入量，这些数据表明，PC可通过诱导琥珀酸分泌到细胞外空间，同时通过回补途径维持TCA循环通量，从而增加了CD8+T细胞的细胞毒性。

图4 PC的活性介导琥珀酸分泌和CD8+ T细胞发挥功能。（A）CD8+T细胞单培养或与B16-OVA肿瘤细胞共培养时RPMI和CM中，分泌的代谢物。6h后进行检测。（B）在RPMI中，单培养的CD8+T细胞和CD8+T细胞与B16-OVA肿瘤细胞共培养，6h后检测的SDHA活性。使用鱼藤酮预处理和琥珀酸处理后测定耗氧率。（C）在RPMI、CM、RPMI+乳酸（10 mM）、RPMI+二甲基琥珀酸、CM+乳酸（10 mM）、RPMI+乳酸（10 mM）+二甲基琥珀酸组中，测定CD8+T细胞与B16-OVA肿瘤细胞共培养的死亡率，24h后进行检测。（D）在RPMI、CM、RPMI+乳酸（10 mM）、CM+乳酸（10 mM）、RPMI+二甲基琥珀酸、RPMI+乳酸（10 mM）+二甲基琥珀酸组中，测定CD8+T细胞与B16-OVA肿瘤细胞共培养的IFNγ水平，24h后进行检测。（E）用PDH抑制剂预处理后，测定RPMI+乳酸（10 mM）中CD8+T细胞分泌琥珀酸的水平。CD8+T细胞用PDH抑制剂预处理24小时（先共培养），6h后进行检测。（F）13C4-琥珀酸标记进入三羧酸循环的示意图。（G）在RPMI中与B16-OVA肿瘤细胞共培养中，检测13C4-琥珀酸对CD8+T细胞中的苹果酸M+4被转导为PC或CTRL的贡献率，6h后进行检测。每个实验重复次数n≥3。误差线表示SD。采用双尾非配对的学生t检验。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。

5. 细胞外琥珀酸激活SUCNR1，导致CD8+ T细胞的细胞毒性增加

由于琥珀酸不是补充TCA循环中间体的主要代谢物，我们研究了这种代谢物作为自分泌信号支持CD8+ T细胞的细胞毒性的潜力。细胞外琥珀酸与细胞表面的琥珀酸受体SUCNR1结合，促进G蛋白偶联信号级联，最终导致转录变化。尽管SUCNR1与炎症反应有关，但SUCNR1和CD8+ T细胞的细胞毒性之间的联系尚未见报道。为了确定CD8+ T细胞分泌的琥珀酸对该受体的自体激活是否重要，我们利用SUCNR1的shRNA评估了CD8+ T细胞的细胞毒性。SUCNR1 KD明显损害了CD8+ T细胞的杀伤力以及IFNγ的产生（图5A-5C）。此外，补充琥珀酸不再增加对SUCNR1 KD的CD8+ T细胞的杀伤作用。

接下来，我们检测了PDH抑制是否可以改变SUCNR1 KD CD8+ T细胞的功能。如图5D所示，PDH抑制剂处理不能改变SUCNR1 KD细胞中CD8+ T细胞的杀伤作用。此外，在有无肿瘤来源的乳酸情况下，琥珀酸受体激动剂（SRA）顺式环氧琥珀酸促进CD8+ T细胞特异性杀伤和IFNγ的产生（图5E-5H）。综上所述，这些数据与在乳酸诱导下的CD8+ T细胞中，代谢重组下游SUCNR1信号通路的模型是一致的。

图5 细胞外琥珀酸激活SUCNR1，促进CD8+ T细胞的细胞毒性。（A）用shRNA转导的SUCNR1或CTRL，并与B16-OVA肿瘤细胞在RPMI中添加二甲基琥珀酸共培养，24h后检测CD8+T细胞的死亡率。（B）CD8+T细胞转导SUCNR1或CTRL并与B16-OVA肿瘤细胞共培养时IFNγ表达的几何平均值。24h后进行检测。（C）CD8+T细胞转导SUCNR1或CTRL的shRNA，并与B16-OVA肿瘤细胞在RPMI中共培养，检测IFNγ的水平，24h后进行检测。（D）检测shRNA转导的SUCNR1或CTRL的CD8+T细胞的死亡率，并在PDH抑制剂预处理后与RPMI中的B16-OVA肿瘤细胞共培养。CD8+T细胞用PDH抑制剂预处理24小时（共培养前）。24h后进行检测。（E）用琥珀酸受体激动剂（SRA）顺环氧琥珀酸预处理后，检测CD8+T细胞与B16-OVA肿瘤细胞在RPMI+乳酸（10 mM）中共培养后的细胞死亡率。CD8+T细胞用SRA预处理24h（先共培养）。24h后进行检测。（F和G）SRA顺环氧琥珀酸预处理后，CD8+T细胞与B16-OVA肿瘤细胞共培养，检测细胞死亡率和IFNγ表达的几何平均值。CD8+T细胞用SRA预处理24h（共培养前）。24h后进行检测。（H）SRA顺式环氧琥珀酸预处理后，CD8+T细胞与B16-OVA肿瘤细胞共培养，检测分泌的IFNγ水平。CD8+T细胞用SRA预处理24h（共培养前）。24h后进行分析。每个实验重复次数n=3。误差线表示SD。采用双尾非配对的学生t检验。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。

6. 在体内抑制PDH可增加TME中琥珀酸的分泌，促进抗肿瘤免疫

接下来，我们使用同基因B16黑色素瘤小鼠模型，研究了PDH的抑制是否增加了TME体内的琥珀酸分泌。我们将B16肿瘤细胞植入8周大的C57BL/6小鼠中。在第8天，当肿瘤形成并可触及时，我们采用25mg/kg的PDH抑制剂CPI-613进行腹腔注射（图6A）。在第15天，我们检测了空白对照组或PDH抑制剂组中，小鼠肿瘤的TIF（TME的标志物）中的琥珀酸水平。PDH抑制特异性地增加了TIF中的琥珀酸水平，但不影响血浆中的琥珀酸水平（图6B）。值得注意的是，PDH抑制对琥珀酸分泌的影响被CD8+ T细胞耗竭抗体的处理方式所抵消。这些数据表明，PDH抑制剂的作用以CD8+ T细胞依赖的方式影响TME中琥珀酸的水平。

接下来，我们检测了PDH活性是否影响CD8+ T细胞肿瘤浸润。为了直接比较在同一TME内有无PDH KD的CD8+ T细胞的浸润情况，我们用PDH或CTRL的shRNA同源性标记的OT-1 CD8+ T细胞进行实验。在B16-OVA肿瘤植入前一天，我们将OT-1 CD8+ T细胞shCTRL45.2和OT-1 CD8+ T细胞shPDH45.1过继共转移至小鼠体内，16天后，我们检测了它们在B16-OVA肿瘤中的数量。首先，我们发现PDH KD OT-1 CD8+ T细胞比对照组T细胞具有更高的肿瘤浸润能力（图6C）。其次，我们发现，与OT-1 CD8+ T shCTRL相比，OT-1 CD8+ T shPDH可单独抑制肿瘤生长（图6D）。

最后，我们在肿瘤建立后使用PDH抑制实验来验证这些结果。PDH抑制剂CPI-613的治疗显著降低了肿瘤的生长（图6E）。肿瘤生长的减少伴随着CD8+ T细胞产生GzmB和IFNγ的增加（图6G，6H）。此外，我们还评估了PDH抑制对其他免疫群体的影响。为了检测PDH抑制是否通过一种仅依赖于CD8+ T细胞的机制来降低肿瘤生长，我们使用特异性抗体清除CD8+ T细胞。CD8+T细胞的消耗降低了CPI-613治疗的效果，表明体内肿瘤的减少是由CD8+T细胞介导的（图6F）。因此，这些发现表明，PDH抑制剂的代谢治疗是通过激活特异性的CD8+ T细胞来发挥作用的。

接下来，我们检测PDH抑制是否会与αPD-1免疫治疗有协同作用。我们在小鼠中植入B16-OVA肿瘤，使用αPD-1（100mg）或空白对照品进行三次注射，使用或不使用PDH抑制剂进行治疗（图6A）。令人惊讶的是，我们发现αPD-1和CPI-613的联合使用进一步降低了肿瘤的生长（图6I）。我们在MC38同基因小鼠模型中重现了这种表型。因为在αPD-1免疫治疗过程中，祖T细胞群（Slamf6+）增殖并产生最终耗尽的T细胞群（Tim-3+），因此，我们检测了PDH抑制是否会影响这种平衡。我们发现PDH抑制对Slamf6/Tim-3细胞群没有显著影响。这些数据表明PDH抑制剂特异性地增强效应T细胞，同时通过独特而互补的机制与免疫治疗产生协同作用。

为了检测SUCNR1在体内CD8+ T细胞中的重要性，我们用SUCNR1或CTRL的shRNA转导先天性标记的OT-1 CD8+ T细胞。在B16-OVA肿瘤植入前一天，我们将OT-1 CD8+ T细胞shCTRL45.2和OT-1 CD8+ T细胞shSUCNR145.1过继共转移至小鼠体内，16天后，我们测量了它们在B16-OVA肿瘤中的数量。值得注意的是，我们发现SUCNR1 KD OT-1 CD8+ T细胞比CTRL OT-1 CD8+ T细胞表现出更低的肿瘤浸润能力（图6J）。为了验证SUCNR1的活性限制CD8+ T细胞体内抗肿瘤细胞毒性活性的假说，我们检测了SRA的作用。我们植入B16肿瘤细胞，在第8天，我们开始腹腔注射1mg/kg的SRA或空白溶剂。与用SRA治疗的小鼠相比，用SRA治疗的小鼠肿瘤生长减少（图6K）。为了证明SRA可以特异性地靶向CD8+ T细胞，我们使用特异性抗体去除CD8+ T细胞。我们发现，在CD8+ T细胞耗尽后，SRA对肿瘤生长无影响（图6L）。因此，这些数据表明SRA效应依赖于T细胞。此外，SUCNR1的激活伴随着CD8+ T细胞IFNγ和GzmB表达的增加（图6M，6N）。

总之，我们已经证明了TME的营养成分可调节CD8+ T细胞的代谢适应度。在溶细胞的CD8+T细胞中，丙酮酸通过PC和PDH为TCA循环提供燃料。具体来说，PC的活性需要补充TCA循环中间体，来介导琥珀酸的分泌。分泌的琥珀酸作为一种信号分子，以自分泌的方式激活SUCNR1。SUCNR1增加T细胞的细胞毒性，从而直接将T细胞的内部代谢程序与其细胞毒性功能联系起来（图6O）。然而，CD8+ T细胞的代谢适应度在TME中受到了损害。肿瘤来源的乳酸改变了丙酮酸进入TCA循环的平衡，从PC活性转向PDH催化的反应，导致TCA循环的回补途径减少，不能维持琥珀酸的分泌来激活SUCNR1（图6N）。值得注意的是，我们的研究结果表明，TME诱导的CD8+ T细胞的代谢重组及其细胞溶解功能可以通过抑制PDH来恢复。

图6 体内抑制PDH可增加TME中的琥珀酸水平，并促进抗肿瘤免疫。（A）使用PDH抑制剂CPI-613（25 mg/kg）或载体±联合同型对照或αPD-1治疗B16 OVA肿瘤小鼠的示意图。同型和αPD-1的使用剂量为100mg（共3个剂量）。（B）检测用载体或PDH抑制剂CPI-613处理的小鼠肿瘤组织液中的绝对琥珀酸水平，并设置有或没有抗体来特异性消耗CD8+T细胞组。在第18天进行分析。n=5。采用双尾非配对的学生t检验。（C）在B16-OVA肿瘤中，用同源标记物转导PDH和CTRL的OT-1CD8+T细胞的百分比（%）。OT-1 shPDH 45.1和OT-1 shCTRL 45.2在B16-OVA肿瘤植入前1天以1：1的比例进行过继转移。在第16天进行分析。n=5。采用双尾非配对的学生t检验。（D）用PDH或CTRL转导的OT-1CD8+T细胞过继转移后小鼠的平均肿瘤生长的体积。肿瘤植入后9天进行过继转移。n = 8。采用Sidak的多重比较检验进行双向方差分析。（E）用载体或PDH抑制剂CPI-613处理的小鼠中显示肿瘤体积的平均肿瘤生长曲线。空白组，n=7；PDH组，n=7。采用Sidak的多重比较检验进行双向方差分析。（F）平均肿瘤生长曲线显示了用PDH抑制剂CPI-613和抗体特异性消耗CD8+T细胞处理的小鼠的肿瘤体积。空白组+αCD8，n=9；PDH+αCD8，n=9。采用Sidak的多重比较检验进行了双向方差分析。（G和H）用载体或PDH抑制剂CPI-613处理的小鼠肿瘤CD8+T细胞中，检测GzmB和IFNγ表达的几何平均值。在第15天进行分析。n=10。采用双尾非配对的学生t检验。（I）平均肿瘤生长曲线显示了用PDH抑制剂CPI-613和同型对照或αPD-1处理的小鼠的肿瘤体积。空白组，n=9；PDH抑制剂，n=8；αPD1，n=8；PDH抑制剂+αPD-1, n = 9。采用Sidak的多重比较检验进行了双向方差分析。（J）在B16-OVA肿瘤中，检测CD45+的OT-1CD8+T细胞的百分比（%），这部分细胞需具有同源标记45.1和45.2转导SUCNR1和CTRL。OT-1 shSUCNR1 45.1和OT-1 shCTRL 45.2在B16-OVA肿瘤植入前1天以1：1的比例进行过继转移。在第16天进行分析。n=5。采用双尾非配对的学生t检验。（K）用SRA顺式环氧琥珀酸处理小鼠的肿瘤体积的平均肿瘤生长曲线。空白组，n=5；SRA，n=5。采用Sidak的多重比较检验进行了双向方差分析。这是两个独立实验中的一个具有代表性的实验。（L）平均肿瘤生长曲线显示了用载体或SRA顺式-环氧琥珀酸处理的抗体来特异性消耗CD8+T细胞的小鼠的肿瘤体积。空白+αCD8组，n=5；PDH抑制剂组，n=5。采用Sidak的多重比较检验进行了双向方差分析。这是两个独立实验中的一个代表性实验。（M和N）用载体或SRA顺式-环氧琥珀酸处理的小鼠肿瘤CD8+T细胞中，检测GzmB和IFNγ表达的几何平均值。在第15天进行分析。n=7。采用双尾非配对的学生t检验。（O）CD8+T细胞-肿瘤细胞代谢回路示意图。左图描述了正常CD8+T细胞的代谢活动。在右侧，肿瘤细胞代谢损害CD8+T细胞活性，导致CD8+T细胞效应功能降低。总的来说，该图显示了细胞外乳酸通过PC或PDH调节丙酮酸的TCA循环进入，并表明T细胞通过SUCNR1促进细胞溶解活性，来进行琥珀酸的分泌。绿色表示上调。灰色和红色表示基因调节下调。误差线代表SEM，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。

讨论

在本研究中，我们证实了TCA循环在代谢匹配的CD8+ T细胞中表现出双重功能，不仅产生代谢中间体，而且还分泌琥珀酸作为自分泌信号分子。琥珀酸激活促炎的SUCNR1受体，以驱动炎症细胞因子的合成和T细胞的细胞毒性。我们发现，TME中大量的肿瘤源性乳酸产生的代谢应激可以重编程CD8+ T细胞的丙酮酸代谢，最终导致无法激活SUCNR1。由于乳酸将丙酮酸通量从PC定向到PDH，CD8+ T细胞在高乳酸条件下重新激活SDHA，导致琥珀酸氧化而不是分泌。重要的是，我们确定了几个代谢节点，即使在高乳酸的条件下，也可以靶向恢复CD8+ T细胞的活性。SUCNR1通过其激动剂顺式环氧琥珀酸或通过抑制PDH增加PC活性和琥珀酸分泌，可促进CD8+ T细胞在TME中的代谢适应度和功能。因此，本研究表明了代谢干预在增强免疫治疗和导致更好的治疗结果方面的潜力。

先前的研究表明，T细胞代谢可通过促进T细胞增殖和影响CD8+T细胞表观基因组产生的代谢中间体，影响T细胞的激活和功能。然而，特别是在复杂的多细胞系统中，识别细胞毒性活性的代谢需求，是很困难的。在本研究中，我们开发了一个平台，允许快速分离肿瘤和T细胞群。这项技术使我们能够分离T细胞-肿瘤细胞相互作用时发生的细胞类型特异性代谢事件，并改变培养基组成，以测试某些微环境因素的影响。通过使用该系统，我们发现在TME中存在高水平的肿瘤来源的乳酸，这是CM对T细胞抑制作用的唯一原因。此外，这种共培养系统让我们利用T细胞依赖的杀伤作用和细胞因子的产生作为CD8+ T细胞效应功能的表征。我们重点关注了在共培养时和乳酸抑制情况下，会被诱导的这些因素，并且共培养系统可观察细胞杀伤过程而不是细胞激活过程的代谢需求。

先前的研究表明，B16黑色素瘤中乳酸的积累损害了CD8+ T细胞和自然杀伤细胞的生存和功能。在机制上，乳酸可以阻止活化T细胞核因子（NFAT）的上调和IFNγ的产生。另一项研究阐明了富含乳酸的环境如何抑制糖酵解过程，并迫使CD8+ T细胞依赖丝氨酸的生物合成来维持T细胞的增殖。我们的研究表明，乳酸对CD8+ T细胞效应功能具有抑制作用。以上研究表明，糖酵解代谢旺盛的肿瘤可能通过多种乳酸介导的机制促进免疫逃逸。

SUCNR1及其下游信号靶点已被研究为包括免疫反应在内的多种生理过程的关键调控因子。尽管有大量关于SUCNR1在炎症中的研究，但很少有人注意到这种受体在癌症中的作用。在这里，我们发现细胞毒性CD8+ T细胞分泌琥珀酸来激活其SUCNR1受体并促进细胞毒性。这些结果进一步解释了SUCNR1在CD8+ T细胞中作为促炎受体的作用。然而，目前尚不清楚是否有其他免疫细胞类型依赖于琥珀酸的分泌来实现受体的自分泌激活。此外，考虑到高乳酸浓度也会抑制巨噬细胞的活性，检测乳酸诱导的从PC到PDH的转换是否也能调节其他免疫细胞类型中的SUNCR1信号通路，将是一件有趣的事情。最后，还需要进一步的研究来阐明癌症中SUCNR1下游的信号通路。研究这些途径如何调节细胞毒性活性，不仅有助于阐明细胞代谢如何满足增殖和细胞毒性的不同要求，还有助于了解代谢受体如何作为CD8+T细胞代谢适应度的传感器。

当我们通过SUCNR1信号确定了连接营养微环境和CD8+ T细胞活性的特定节点时，我们还验证了代谢靶点可以增强CD8+ T细胞在这种恶劣环境中的适应度，从而覆盖TME的抑制作用。值得注意的是，将丙酮酸通量从PDH定向到PC或直接激活SUCNR1可以克服乳酸诱导的CD8+T细胞抑制。此外，我们还发现了PDH的抑制作用可通过特异性增强效应T细胞，与αPD-1免疫治疗具有协同作用。这些发现具有直接的治疗意义，因为我们使用的PDH抑制剂目前正在临床试验中。最后，靶向乳酸的产生可能是另一种治疗方法。

总之，我们的结论是，在模拟TME的条件下绘制T细胞代谢可以提供有价值的见解，并识别新的靶点，以改善这种不利环境中T细胞的功能。

结论

在这项研究中，我们证实了CD8+ T细胞在体外模拟TME条件下的代谢重组。然而，肿瘤浸润淋巴细胞的体内追踪仍是该领域的一些技术挑战，主要是由于T细胞从肿瘤中长期分离过程，不可避免地影响代谢作用。此外，从肿瘤中获得大量的T细胞用于常规生物化学也是一个技术挑战。因此，为了探究我们在体内发现的相关性，我们调节了体内最重要的代谢节点，并测量了T细胞的效应功能。

此外，我们鉴定了SUCNR1作为CD8+T细胞代谢适应度的传感器，负责平衡CD8+T细胞的细胞毒性输出和营养可用性。在未来，为了确定该受体如何影响癌症中CD8+T细胞的功能，研究者需要重点描述SUCNR1下游的信号通路。

原文链接：

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35820416/